傷口愈合實驗-干細胞侵襲

傷口愈合實驗是體外研究細胞遷移的的一個有用的實驗。原理是人為的在鋪板的單層細胞中制造一個空白的無細胞的地帶，然后對這個無細胞地帶的邊緣的細胞進行觀察；這些邊緣的細胞會開始進行遷移活動，并且終覆蓋整個無細胞的區域，重新互相接觸在一起。法國的科研人員在2015年的 STEM CELL上發的文章中提出神經生長因子（NGF）和神經生長因子前體（proNGF）會自動的激活乳腺癌干細胞，并且發生侵襲。文中，使用乳腺癌細胞系和腫瘤分離的細胞進行傷口愈合實驗，得出，由NGF處理的腫瘤離的乳腺癌細胞的傷口愈合速率有非常顯著的提高。說明在NGF能促進乳腺癌細胞遷移活動。

Nerve Growth Factor and proNGF Simultaneously Promote Symmetric Self-Renewal, Quiescence, and Epithelial to Mesenchymal Transition to Enlarge the Breast Cancer Stem Cell Compartment

E. Tomellini, Y. Touil, C. Lagadec, S. Julien, P. Ostyn, N. Ziental-Gelus, S. Meignan, J. Lengrand, E. Adriaenssens, R. Polakowska and X. Le Bourhis

STEM CELLS, 2015, 10.1002/stem.1849

在文中，使用Ibidi開發的傷口愈合插件進行了傷口愈合實驗。這是一種雙孔的硅膠插件，可以放在培養皿中，插件兩孔間的孔壁寬度為500μm。將細胞種在插件中，等待細胞貼壁長滿后，將插件移除，這樣，兩孔間的縫隙就是一個無細胞的“劃痕”。

1. 實驗材料

• 細胞:     MCF-7 、腫瘤分離細胞
• 實驗耗材:   傷口愈合插件培養皿 (ibidi, 81176) 
• 細胞培養基:  MEM medium
• 試劑:  EGF  （sigma， E9644）

           bFGF （R&D，233-FB）

           NGF  （Scil Protein）

           proNGF （Alomone Labs，N-285）

• 滅菌鑷子

1. 實驗步驟

1. 鋪細胞（圖三）

• 將ibidi傷口愈合培養皿底部的保護膠帶撕除。
• 在ibidi細胞插件的每孔中加入1 × 104的細胞懸液。注意不要大力晃動培養皿。以防止細胞不均勻。
• 在37。C培養箱中孵育24小時。

圖三：A. 去除培養皿底部的保護膠帶。B.C.在ibidi傷口愈合插件中加入細胞。

1. 形成“劃痕”

• 采用無血清MEM培養基培養細胞4小時
• 如圖四所示，小心的用鑷子夾住插件的一個角，將插件移除。 

• 移除插件后，要用顯微鏡檢查是否形成合格的“劃痕”。
• 小心的清洗細胞，之后加入2ml培養基進行培養（圖五）。

1. 采集并分析圖像

• 在顯微鏡下選取能同時看到“劃痕”和兩邊細胞的視野進行成像，“劃痕”的方向好是水平或者垂直。
• 采集0h和4h的圖像，并且分析每張圖的細胞覆蓋劃痕區的面積。

（三）實驗結果

如圖所示，ML表示MCF-7 細胞系。腫瘤分離細胞團分別由EGF、bFGF、NGF和proNGF處理，由t-EGF/bFGF、t-NGF、t-proNGF表示。可以看到由NGF處理的細胞，在4h的時候覆蓋面積大，遷移速率快。