鈣離子成像顯著增強(qiáng)了B細(xì)胞受體介導(dǎo)的Ca2+活動(dòng)

在生物有機(jī)體內(nèi)，鈣離子傳遞了各種各樣的胞內(nèi)信號(hào)，這些信號(hào)幾乎在每種類型的細(xì)胞中都存在，而且在很多方面都有非常重要的作用。在很多細(xì)胞活動(dòng)的時(shí)候，胞內(nèi)鈣離子的濃度會(huì)顯著升高。鈣離子成像是利用鈣離子特異染料，將細(xì)胞中的鈣離子濃度通過(guò)熒光強(qiáng)度表現(xiàn)出來(lái)，從而達(dá)到檢測(cè)細(xì)胞活動(dòng)的目的。德國(guó)的科學(xué)家通過(guò)研究B細(xì)胞胞質(zhì)中鈣離子濃度來(lái)研究 Rho GTPase Rac 對(duì)于B細(xì)胞功能的重要影響，研究發(fā)現(xiàn)，RacPLCγ2可以通過(guò)增強(qiáng)胞漿內(nèi)的Ca2+濃度來(lái)影響B細(xì)胞受體（BCR）發(fā)揮作用。

文中，研究人員用BCR和Ca2+分別處理DT40 Bcell，觀測(cè)DT40B cell中鈣離子的濃度變化。研究人員研究了在這樣的處理下，Unmodified DT40 cells ( PLCγ2+/+), PLCγ2-/- cells，PLCγ2-/- cells stably expressing wild-type 這幾種細(xì)胞的鈣離子濃度變化，說(shuō)明了PLCγ2，Ca2+和BCR之間的關(guān)系。

Rac-mediated stimulation of phospholipase C-gamma-2 amplifies B cell receptor-induced calcium signaling

C. Walliser, K. Tron, K. Clauß, O. Gutman, A. Kobitski, M. Retlich, A. Schade, C. Röcker, Y. Henis, G. Nienhaus and P. Gierschik

Journal of Biological Chemistry, 2015, 10.1074/jbc.M115.645739

1. 實(shí)驗(yàn)材料：

1. DT40 B細(xì)胞
2. Poly-L-Lysine          0.01%（w/v)
3. Fluo-4 AM             2μM
4. Pluronic F-127        0.02%（v/v）
5. RPMI 1640

1. Buffer B         20 mM Hepes/NaOH, pH 7.4；143 mM NaCl；6 mM KCl；1 mM MgSO4；5.6 mM glucose

1. CaCl2                1mM 
2. 六通道載玻片          無(wú)包被，德國(guó)ibidi公司，80601

圖一：ibidi六通道載玻片，可見(jiàn)載玻片上有六個(gè)平行通道，可以做六組平行實(shí)驗(yàn)。或者用不同的樣本。通道載玻片的特點(diǎn)是單通道容積很小，需要的試劑量只有30μl。其底部可以直接使用油鏡，進(jìn)行高分辨率成像，光學(xué)效果。本文中，是使用共聚焦顯微鏡觀測(cè)鈣離子染料的熒光值。

1. 實(shí)驗(yàn)步驟

• 使用0.01%（w/v)的多聚L賴氨酸（Poly L-Lysine）對(duì)六通道載玻片進(jìn)行包被
• 單通道鋪入3×105 DT40 B細(xì)胞，37℃,10%CO2環(huán)境中孵育45分鐘待細(xì)胞貼壁。
• 使用無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基，輕輕沖洗通道，移除未貼壁細(xì)胞（圖二）。

圖二：沖洗換液方法，藍(lán)色代表新的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基

• 用RPMI 1640培養(yǎng)基加入2 µM fluo-4 AM, 0.02 % (v/v)Pluronic® F-127，加入通道中，孵育30分鐘。
• 用Buffer B沖洗兩次細(xì)胞，可以用加入 BCR抗體 anti-IgM或 1 mM CaCl2做為刺激液。
• 使用共聚焦顯微鏡觀測(cè)數(shù)據(jù)。

1. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖三： 由圖中曲線可以看出，在沒(méi)有胞外Ca2+存在的時(shí)候，對(duì)BCR的刺激（加入 BCR抗體 anti-IgM）和B細(xì)胞中鈣離子活動(dòng)成比。而當(dāng)有胞外Ca2+的時(shí)候（加入1mM CaCl2）胞外對(duì)于胞內(nèi)鈣離子的活動(dòng)也有非常顯著的影響，會(huì)隨著Anti-IgM的升高，胞內(nèi)鈣離子濃度會(huì)降低。